實現本應用自動化的三大理由

哺乳動物體外細胞培養物的可用性是藥物發現的一個關鍵瓶頸。為了將哺乳動物細胞作為基于細胞的高通量測試的資源，必須克服人工細胞繁殖缺乏標準化、重復性差和通量不足的問題。

• 提供大量培養細胞。

• 確保可重復性和過程安全性。

• 標準化哺乳動物細胞增殖。

簡介

在藥物篩選和細胞生物學研究中對哺乳動物細胞的需求不斷增加。在高通量篩選中，候選藥物的評估基于其對細胞培養的生物效應，在基于細胞的ADME-T測定中測試新化合物的代謝行為和毒性。基礎研究依賴于大量的細胞系和原代細胞，它們構成了闡明細胞增殖、分化和功能的基本機制的工具。在這個領域，胚胎干細胞作為一個模型系統越來越重要。這些細胞除了具有巨大的分化潛能外，還具有無限自我更新的能力，這有助于它們進行有效的基因修飾。目前使用的細胞培養方法的局限性包括缺乏標準化與重復性差和通量不足。由此可見，細胞的可用性會成為實驗全流程的瓶頸。HAMILTON和Life&Brain結合了他們在原代細胞、細胞系和胚胎干細胞自動培養系統開發方面的專業知識，該系統可大量提供高質量的細胞。

方法描述

該系統的典型流程包括：

• 預定運行期間細胞培養板中培養基的更換

• 胰蛋白酶化后細胞培養物的收集

• 在培養孔內均勻地接種細胞

• 向細胞培養物中添加生長因子或藥理活性物質

通常培養基更換在隔夜運行中進行，如下所示：

• 通過工作列表選擇感興趣的微孔板

• 計算容器中的適量培養基，并從冷培養箱中獲取；然后將培養基容器轉移至加熱位置

• 將第一個板從溫培養箱轉移到移液工作站，并去除殘留的培養基

• 使用一次性吸頭或可洗鋼針更換培養基

• 將微孔板轉移回培養箱中

手動溫和處理 - 轉移至自動化流程

Hamilton的液體處理技術可以模擬典型的手動操作，例如板混勻或溫和移液。本品非常適合處理脆弱的哺乳動物貼壁細胞，如胚胎干細胞。

技術

Hamilton“無管” 技術: Hamilton 監測空氣置換（MAD）移液技術消除了管、泵或系統液體的使用，從而顯著降低了細菌生長造成污染的風險。

接種

這采用Cellhost系統接種可使小鼠胚胎干細胞均勻分布在飼養細胞層上。在胚胎干細胞的情況下，細胞的均勻分布尤為重要，因為細胞團塊的形成導致不受控制的分化。為了達到這一結果，用機械手模擬在微孔板上分配細胞的典型手動動作。套系統主要由8通道的Microlab   STARlet液體處理工作站構成，手動裝載吸頭、試劑、濾膜板和PCR板的載架，真空抽濾系統整合在工作站的臺面上。在操作過程中，通過CO-RE抓手來移動微孔板、裝載及拆卸抽濾板架。

培養基更換

細胞培養中最常見的流程是培養基的更換。為了最大限度地減少殘留量，在一側升高細胞培養板（圖2），并在孔的底端小心吸出培養基。在孔邊緣緩慢加入新培養基，從而避免干擾細胞層。顯微鏡研究顯示細胞層的完整性（圖3a）-與不太謹慎的手動實驗形成鮮明對比（圖3b）。

系統描述

Cellhost系統的核心是配備內部機械手iSWAP的Microlab STAR移液工作站。其在平臺上處理SBS標準細胞培養板。兩個Kendro培養箱整合到系統中（圖1）。系統的模塊化架構允許將附加組件整合到臺面上，例如成像系統。

應用軟件

該系統由標準PC和Hamilton開放靈活的Microlab Venus軟件控制，用于過程控制和第三方組件整合。任何設計用于處理大量板的自動化系統，每個板都經歷復雜的操作且需具備數據跟蹤能力。Hamilton Celltask軟件可輕松安排重復過程，使細胞培養自動化操作非常簡便（圖4）。Celltrack軟件監測并跟蹤每個板上的每個操作，并根據CFR 21第11部分的要求進行數據文件記錄。

系統的生物驗證

根據GLP，使用胚胎干細胞（最敏感的細胞培養范例之一）驗證了Cellhost系統。已經明確驗證了生物可行性：

•  移液（接種、收集）后細胞的活力

•  更換培養基后細胞層完整

•  接種后細胞在孔中的均勻分布

•  使用可清洗鋼針時無交叉污染

結果

用Cellhost培養的胚胎干細胞在接種和更換培養基后保留其典型形態（圖5）。自發分化的程度不超過在人工處理的培養物中觀察到的程度。通過堿性磷酸酶活性的組織化學檢測來驗證多能狀態的維持。培養48小時后的細胞活力與手動對照實驗中測定的相當。未檢出污染。

通量和容量

6孔板2ml培養基的處理時間：

•  培養基更換：340s

•  細胞收集：1500s

•  滋養細胞制備：520s

•  胚胎干細胞（ESC）板的制備：940s

•  細胞培養箱可擴展至容納1000個96孔板

討論

這項研究的結果表明了胚胎干細胞培養自動化的可行性。此處使用的系統優點是基于手動方法并且不需要液體補充模塊。細胞在各種移液步驟中容易存活，如機械接種和反復更換培養基。顯微鏡觀察顯示，胚胎干細胞的典型形態得以保留。此外，與手動對照相比，未觀察到自發分化增加-這明確表明Cellhost溫和處理細胞。該系統以無污染的方式運行。可以預期，為胚胎干細胞精細培養而開發的過程可以轉化為毒理學試驗和藥物篩選中常用的不太敏感的細胞類型。為進一步自動化細胞系（如CaCo2）和下游應用（如報告基因分析）掃清了道路。隨著細胞培養的自動化，制藥和生物技術公司的人工工作量大大減少。